传统毒理学是以整体实验为主来研究药物毒性，在人力、物力、时间和财力等方面都花费巨大，也无法满足海量候选化合物毒性筛选的需要，因此成为限制整个药物研发的瓶颈。而发现毒理学的研究将打破这个瓶颈，既可加快药物研发进程，提高研发成功率，又能减少资源消耗。发现毒理学是指在新药发现阶段或药物的研发早期对新分子实体(newmolecularentities，NMEs)进行毒性筛选，及时发现和淘汰因毒性问题而不适于继续研究开发的化合物或化学结构，或者是有针对性地设计一些实验研究，解决某些重要化合物的特异性毒性问题，指导合成更安全的同类化学物。

3.2　从整体实验向体外实验转化

近年来，随着实验动物使用的3R(Reduction,Refinement，Replacement)甚至4R(增加Responsibility)原则的倡导与实施，整体动物实验面临严峻挑战，建立符合3R原则的动物实验替代法已经成为毒理学研究方法发展的必然趋势。毒理学替代法指能替代实验动物、减少所需动物数量或使动物实验程序得以优化或减少动物痛苦的方法或程序。其主要从QSAR模型、体外试验或应用基因组学、蛋白质组学、代谢组学技术来建立，其中，利用体外实验进行毒性预测的替代法发展最为迅速，如用于评价药物肝毒性的离体肝脏灌流模型和用于评价生殖毒性的胚胎干细胞试验。现阶段动物替代实验方法已大量应用在药理毒理学研究中，其应用价值逐渐被研究者认同。目前的迫切任务是对这些实验方法进行有效性验证并探索实践新的技术方法，以获得药政管理部门的认可,使其用作药物毒理学研究模型。

3.3　从器官、组织水平向分子、基因水平转化

和任何学科发展一样，药物毒理学的发展离不开实验方法和技术的不断改进、创新和完善，组学技术的迅速发展，实现了从整体和器官水平向细胞和分子水平甚至基因水平的飞跃，促进了毒理学各个研究领域的发展，对毒理学研究方法、技术的改进产生了重大影响。

4.1整体动物在药物毒理学研究中的应用_

4.1.1 正常动物

在毒理学领域，药物的安全性评价体系常用到正常动物，包括啮齿类动物（如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠等）和非啮齿类动物（如家兔、比格犬、猴、小型猪等），这些正常动物主要用于进行急性毒性实验、长期毒性实验和特殊毒性实验等。通过不同的给药方式给予相应的受试药物一定时间后，采用特定方法测定各项生理生化指标用于评价受试药物对健康动物有无毒性，并以此确定试验动物对毒物的毒性反应、中毒剂量（poisoning dose）和致死剂量（lethal dose）等，为药物进入临床阶段提供参考依据并将结果外推至人类。经过毒理学工作者的不断努力，传统的急性毒性实验已经在减少动物的使用量上取得了很大的进步，主要表现为应用上下法、固定剂量法、探测剂量法、近似致死剂量法等新的方法替代传统的急性毒性实验，并已经很大程度上减少了实验动物的使用量。

4.1.2 基因动物

对受试物进行器官毒性评价等研究时，经常使用各种模型动物。将诱发性模型动物、转基因动物、基因敲除动物应用到实验当中，进而研究各种模型下应用受试物后机体的异常反应，以寻找预测各类疾病更加有效的手段。石艳等用庆大霉素诱导急性肾损伤大鼠模型来测定肾损伤分子-1（kim-1）的表达，并明确了kim-1 可作为庆大霉素所致肾小管损伤的早期诊断标志物。在毒理学研究领域中，重要的问题是如何把从整体动物获得的资料外推至人类，把体内外信息结合，把复杂的整体系统化为简单的可控系统，以及如何提高检测的敏感性等。建立转基因动物模型为解决这些问题提供了新手段。转基因动物模型主要分为一般毒性研究模型、致突变检测模型、致癌检测模型、生殖检测模型和毒物代谢研究模型。，这些转基因动物的应用不仅提高了实验动物的敏感性，也一定程度上满足了动物福利的要求，并且大大缩短了药物毒性评价时间。继转基因技术后，基因敲除动物技术掀起又一场分子生物学技术的革命。这是一种在基因组水平上改变或破坏靶基因结构，使其功能完全丧失的实验技术。该系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加可靠，它的发展将

为发育生物学、分子遗传学等学科提供一种全新的研究手段，具有广泛的应用前景。目前，基因敲除动物模型主要用于遗传性疾病的研究，现在也用于器官移植、免疫耐受、基因功能鉴定以及表型研究。整体动物在毒理学研究中应用广泛，不同的转基因动物模型和基因敲除动物模型的建立，将对阐明外源化学物毒性作用机制起到重大作用。但是该方法制作基因动物模型效率低，动物行为难以控制，且基因整合机制不清，存在一定局限性。

4.2 体外替代实验技术的发展

使用正常动物的实验在毒理学研究的应用中存在着不敏感、周期长、所需受试物样品多、所需实验动物量大、难以揭示毒作用位点和毒作用机制以及结果可靠性差等问题。而模型动物也存在着制造价格昂贵、受世界动物保护法限制等不足之处。因此，在“3R”原则（替代、优化、减少，replacement、refinement、reduction）的指导下，一些发达国家率先开展了替代方法的研究。目前体外替代方法的研究已成为实用性毒理学领域研究的新方向。主要包括离体器官实验和体外细胞培养实验。

4.2.1 离体器官实验

以体内脏器为基础的体外模型，一方面保留着完整的营养供给系统，能够确保在一定时间内保持离体器官的正常生理活性及生化功能，另一方面离体系统可排除其他组织器官的干扰，可控制受试物浓度，并可定量观察受试物对离体系统的毒性作用。目前，离体器官实验主要采用离体灌流技术，包括离体的肝脏、肾脏、心脏灌流技术等，用于研究外源化合物的靶器官毒性。

4.2.2 体外细胞培养

体外细胞培养使毒理学研究从简单的整体动物实验深入到复杂的细胞和分子水平，脱离了整体稳态和内分泌调控作用，从蛋白质、酶、受体、分子通道以及遗传因素等方面解析了药物与机体间的相互作用，在投药准确性和结果可靠性上显示了优越性。作为体外细胞实验金标准的原代肝细胞培养技术广泛应用在毒理学研究各领域，如通过测定培养肝细胞中转氨酶的活性，评价有机和无机化合物的肝细胞毒性，通过体外培养原代人肾细胞评价霉菌素在人体外肾细胞的吸收、分布、代谢和毒性作用，都获得了很好的结果。

4.3 组学技术

4.3.1 “组学”的形成

传统的体内体外实验主要以整体动物或应用体外培养低等生物、高等生物的组织、细胞、细胞器为模型，以细胞学、生理学、形态学和代谢等生物学指标为检测终点，对药物进行早期毒性筛选及机制研究。生物物种间生理代谢均存在差异，将以上实验结果外推至人类，预测药物对人体的毒性反应是否可靠，仍是值得深究的问题。为了弥补传统毒理机制研究方法的不足，近年来国内外毒理学工作者正致力于一系列的组学技术研究。目前把对细胞内DNA、RNA、蛋白质、代谢中间产物的整体分析手段称为组学技术，主要包括基因组学（genomics）、

蛋白质组学（proteomics）和代谢组学等。Nount利用这些组学技术对候选新药进行毒理机制研究，从而开创了“反向毒理学”的药物毒性机制研究新模型。组学技术的发展实现了从器官、组织水平向分子甚至基因水平的飞跃。

4.3.2 基因组学

基因组学利用基因组学的相关信息，将遗传学与生物信息学相结合，从基因整体水平研究外源化合物的毒性作用，建立毒性作用与基因表达变化之间的关系，从而有效监测接触外源化合物后基因水平的改变，继而筛选和鉴别潜在的遗传毒物，并快速确定未知毒物的作用机制。毒物基因组学（toxicogenomics）将基因组学方法与技术应用于毒理学研究领域，主要采用DNA微阵列技术研究毒物和毒作用机制，其快速发展为毒理学开辟了新的研究领域。基因组学技术有助于对毒物进行分类、检测，鉴定毒作用机制亚型，判断细胞损伤的严重程度并阐明化学物的各种量–效关系。可以说，基因组学技术的发展对毒理学研究方法、技术的改进产生了巨大的影响，但是基因组学理论尚不完善，存在着一些亟待解决的问题。例如，基因组学技术无统一的标准要求；基因表达的改变与疾病的关联问题模糊不清等。

4.3.3 蛋白质组学

当从mRNA 水平考虑和对单个蛋白质进行的研究已无法满足后基因组时代的要求时，蛋白质组学（proteomics）应运而生。蛋白质组学是指研究蛋白质组或应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是在蛋白质整体上对疾病机制、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。蛋白质组学以直接参与生命活动的蛋白质为研究目标，界定表达蛋白质过程中涉及的影响因素，现已广泛融入环境科学、生态毒理学等众多领域。目前，对蛋白质组进行分离的方法有多种，主要包括二维凝胶电泳、二维液相色谱、毛细管电泳和液相色谱-毛细管电泳等技术。蛋白质组完成分离之后继而通过质谱技术、蛋白质测序技术、氨基酸组成成分分析等技术对其进行鉴定以及功能研究。毒理蛋白质组学作为毒理基因组学的延伸也已经应用到毒理学研究领域当中，是一种利用全蛋白质表达分析技术，确认生物物种受有害外源化学物影响的关键蛋白质和信号通路的组学技术。该技术通过比较特定细胞、组织或器官在毒物作用前后蛋白质谱发生的变化，在短时间内筛选出与毒物相关的差异蛋白，再通过抗体分析技术快速寻找新的毒性蛋白标志物，因此比传统毒理学研究方法更具灵敏性和特异性。

4.3.4 代谢组学

基因组学、蛋白质组学的迅猛发展为毒理学研究带来了新的发展契机，大大促进了毒理学的发展。然而，基于蛋白质组学的研究不能提供机体对外源性毒物刺激的整体应答信息，也不能反映出基因、疾病、毒物等相关因素之间的交互作用，存在一定的局限性。因此，继基因组学、蛋白质组学之后产生了一种重要的系统生物学——“代谢组学”（metabonomics）。代谢组学是应用现代分析方法对某一生物或细胞在某一特定生理时期内所有低相对分子质量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科，被认为是“组学”研究的终点，具有全面、

高通量、无偏差地研究生物体内代谢途径的特点。理、药物药效学评价、药物作用机制、临床诊断以及基因功能等方面的信息。该研究常用核磁共振和质谱联用技术，包括气相色谱-质谱联用仪和液相色谱-质谱联用仪等。其中核磁共振光谱分析法应用最为广泛，具有不损害样品、处理方法简单、无需分离过程等优点，但其检测灵敏度较低。Nicholson研究小组多年来致力于代谢组学的研究，用代谢组学方法对药物毒性影响的组织器官及其位点进行判断进而推测药物作用机制，并确定毒性潜在生物标志物，为药物的毒性评价做出了巨大贡献。

全程式新药安全性研究评价新模式的首要特征是重视“发现毒理学”在新药开发中的作用。作为创新药物研发体系的重要组成部分，国内药物毒理学在学科建设、服务创新药物研发和GLP 建设中均取得了很大的发展。从传统的临床前评价、临床评价的两阶段模式，向早期发现毒理学、临床前评价、临床评价、上市后监督再评价的四阶段全程评价模式转变，形成了全程式新药安全性研究评价的新模式。我国的早期发现毒理学建立了一整套药物早期毒性优化筛选系统，引进了计算机毒性预测系统Topkat；全程式药物毒理学评价新模式；在实验技术上开展了以转基因与人源化的动物、干细胞体外培养、高内涵与高通量筛选、毒理“组学”等为代表的新兴生物医学技术研究。近年来，为服务于创新药物研发的需要，我国已建立了一整套药物早期毒性优化筛选系统，包括检测基本细胞毒性的MTT 比色法，检测遗传毒性的Ames 波动试验、Mini-Ames 试验、SOS 显色试验、基于腔室载玻片的体外微核试验及染色体畸变试验、Vitotox试验和Green Screen HC试验等；检查生殖毒性的体外检测睾丸毒性的大鼠种质细胞原代培养、支持细胞原代培养、原代种质细胞与支持细胞共培养试验等；检测发育毒性的大鼠着床后全胚胎培养试验、小鼠胚胎干细胞试验、中脑细胞微团培养试验和基于PC12 细胞的体外发育神经毒性试验等；体外检测致癌性的人永生化支持细胞株培养等模型；以及基于GFP 报告基因系统的CYP450 诱导活性的检测模型。在药物致癌性评价中，将转基因动物模型与野生型动物模型相结合作为替代致癌性试验方法，已得到广泛的应用。体外检测致癌性的人永生化支持细胞株培养等模型，以及基于GFP报告基因系统的CYP450 诱导活性的检测模型的有效性和可靠性已在相关药物的研发实践中得到了证实。全程式药物毒理评价模式为我国创新药研发提供了有力的安全性保障，并成功地为解决国内近几年在临床和上市后发生的肝素钠、马兜铃酸等药物不良反应事件提供有力技术支撑。

大量新技术和新方法的应用使毒理学研究水平更加深入,药物的毒性评价将从目前的模式逐步发展到体外细胞、分子水平的毒性测试与人体志愿者试验相结合的新模式。相比国外药物毒理学的发展现状，国内药物毒理学在关键技术的建立与新技术新方法的应用等方面还有一定的差距,作为毒理学工作者，需加强新模型应用、组学技术、生物标志物等领域的研究力度，提高我国创新药物毒理学研究的水平，为医药产业的健康发展奠定基础，最终为人类提供更安全、有效的药物。