随着胡安娜的哥哥阿斯图里亚斯亲王胡安离世，胡安的女儿伊莎贝尔是个死胎，胡安娜的姐姐伊莎贝尔和伊莎贝尔的儿子米格尔也接连去世，胡安娜成为了西班牙王国的女继承人。当时，胡安娜还在世的妹妹包括：玛丽亚（1482年-1517年）和凯瑟琳（1485年-1536年），分别比胡安娜小3岁和6岁。1502年，卡斯蒂利亚的托罗议会承认胡安娜是卡斯蒂利亚王位的继承人，腓力是她的王夫。她被封为阿斯图里亚斯女亲王，这是传统上授予卡斯蒂利亚继承人的头衔。

同年，阿拉贡议会在萨拉戈萨召开，宣誓胡安娜为女继承人；然而，萨拉戈萨大主教坚称这一誓言只能通过一项国王和议会间的有关继承权的正式协议才能确立法理。1502年，为了让胡安娜以卡斯蒂利亚王位女继承人、阿斯图里亚斯女亲王的身份接受卡斯蒂利亚议会的宣誓效忠，胡安娜、腓力和勃艮第宫廷的大部分人前往托莱多，这次旅程被安托万一世·德·拉兰详细载入编年史。次年，腓力和宫廷大多数人返回低地国家，身怀有孕的胡安娜被留在马德里，她在那里生下了她和腓力的第四个孩子，即后来的中欧君主，神圣罗马帝国皇帝斐迪南一世。

当伊莎贝尔一世于1504年11月去世后，胡安娜成为了卡斯蒂利亚的执政女王，她的丈夫腓力也依据妻子的权利成为了国王。胡安娜的父亲费尔南多二世在卡斯蒂利亚丧失了君主身份，尽管伊莎贝尔在遗嘱中允许他在胡安娜缺席时统治，或者，如果胡安娜不愿意自己统治，他可以继续执政直到胡安娜的继承人年满20岁。费尔南多拒绝接受这一事实，他以“费尔南多和胡安娜，卡斯蒂利亚、莱昂和阿拉贡的国王和女王”的名义铸造卡斯蒂利亚货币，并于1505年初让议会相信胡安娜病得很重，无法执政。随后，议会将费尔南多任命为胡安娜的监护人，王国的管理者和统治者。胡安娜的丈夫腓力不愿让自己统治卡斯蒂利亚的机会受到任何威胁，他也以“腓力和胡安娜，卡斯蒂利亚、莱昂的国王和女王，奥地利大公夫妇，等”的名义铸造货币。针对这一情况，费尔南多开始实施亲法政策，他迎娶了法国国王路易十二的外甥女热尔梅娜·德·富瓦（她同时也是费尔南多的甥孙女），希望她能生一个男孩来继承阿拉贡也许还有卡斯蒂利亚。

费尔南多的再婚仅仅提高了胡安娜和腓力在卡斯蒂利亚的支持度，1505年底，夫妇二人决定前往卡斯蒂利亚。胡安娜和腓力于1506年1月10日离开佛兰德斯，他们的船队在英国海岸失事，作为威尔士亲王亨利（后来的英格兰国王亨利八世）和威尔士王太妃凯瑟琳的客人，两人拜访了温莎城堡。直到内战在卡斯蒂利亚一触即发，他们才于4月21日再度启程。据说，腓力本打算在安达卢西亚登陆，然后召集贵族在阿拉贡与费尔南多开战。但他们却于4月26日在阿科鲁尼亚登陆，于是卡斯蒂利亚贵族集体抛弃了费尔南多。

1506年6月27日，腓力和费尔南多在比利亚法菲拉会面，双方在一座乡村教堂内进行了一场秘密会谈。令人惊讶的是，费尔南多出人意料地将卡斯蒂利亚政府交给了他的“最心爱的孩子”，承诺退休到阿拉贡。随后，腓力和费尔南多秘密签署了第二项协议，双方就胡安娜因“体弱和病痛”无法执政达成一致，并承诺将她排除在政府之外，剥夺她身为女王的王权和自由。同日下午，费尔南多立即否认了第二项协议的存在，并宣布胡安娜作为卡斯蒂利亚执政女王的权利绝不该被剥夺。两周后，费尔南多没有与腓力达成新的协议，因此，如果费尔南多认为胡安娜的权利受到了侵犯，他有权对此进行干涉。费尔南多放弃卡斯蒂利亚回到阿拉贡，让腓力代替胡安娜执政。

由于比利亚法菲拉协议的达成，1506年7月9日，议会官员在卡斯蒂利亚巴利亚多里德会晤。7月12日，他们共同宣誓对卡斯蒂利亚和莱昂的国王和女王腓力一世和胡安娜以及他们的法定继承人，未来的神圣罗马帝国皇帝查理五世效忠。但这一安排仅持续了几个月。1506年9月25日，腓力在卡斯蒂利亚布尔戈斯去世。官方公布的死因是伤寒。一般舆论公开认为是腓力的岳父，一直不喜欢他的外国哈布斯堡血统并且从未想过与他分享权利的费尔南多二世用“博卡多（bocado）”毒害了他。此时，胡安娜正怀着他们的第六个孩子，一个名叫卡塔琳娜的女儿（1507-1578），即后来的葡萄牙王后。

到1506年12月20日，胡安娜在卡斯蒂利亚托克马达试图以自己的名义单独行使她作为卡斯蒂利亚女王的统治权。国家陷入了混乱。她的儿子兼法定继承人查理是个6岁的孩子，在北欧佛兰德斯由姑母抚养长大；她的父亲费尔南多二世仍留在阿拉贡，使得危机不断扩大。西斯内罗斯大主教领导建立了一个摄政委员会反抗女王的命令，但依旧无法控制日益严重的社会骚乱。瘟疫和饥荒席卷王国，据推测，有一半的人口因此去世。女王无法获得巩固政权所需的资金。面对纷繁复杂的形势，费尔南多二世于1507年7月返回卡斯蒂利亚。费尔南多抵达时恰逢瘟疫和饥荒得到了控制，新的事态发展缓和了动荡不安的局势，也让人们觉得是费尔南多的回归让王国恢复兴旺。

费尔南多二世和胡安娜于1507年7月30日在卡斯蒂利亚奥尔尼约斯会面。随后，费尔南多强迫胡安娜把卡斯蒂利亚和莱昂王国的统治权交给自己。1507年8月17日，三名王家委员会成员被传唤——据说是以胡安娜的名义——并奉命将费尔南多二世重新掌权的消息通知贵族：“他们应该去接见殿下，并像对待她那样为他服务。”然而，胡安娜明确表示此举违背了她的意愿，她拒绝在文件上签字并发表声明称，作为执政女王她不会签署强迫自己放弃王权的法令。

虽然如此，此后胡安娜只是有名无实的女王，虽然所有文件都以她的名义发表，但文件上签的却是费尔南多的署名——“I the King”。1510年，费尔南多被卡斯蒂利亚议会任命为王国管理者，并将政府主要托付给西斯内罗斯大主教。费尔南多遣散了胡安娜的所有忠仆，并指定了一小批随从去侍奉她。随后，胡安娜于1509年2月被费尔南多囚禁在卡斯蒂利亚巴利亚多利德附近的托德西利亚斯王宫。就在这时，一些描述称胡安娜精神失常或“发疯”，她把丈夫的遗体带到托德西利亚斯，让他紧挨着自己。

1516年1月23日，费尔南多在愤恨中离世：他的第二段婚姻未能给他带来一位存活的男性继承人，让他的女儿胡安娜成为了他的推定继承人。费尔南多对自己去世后卡斯蒂利亚和阿拉贡实际上会传给在外国出生和长大的外孙查理感到愤怒，他将自己对腓力的憎恨转移到外孙身上。费尔南多希望自己的另一个外孙，查理的弟弟，与他同名且在卡斯蒂利亚出生和长大的斐迪南一世能接替自己。

一开始，费尔南多二世在遗嘱中将斐迪南一世指定为自己的继承人，但在他人的说服下，费尔南多二世撤销了这笔遗赠，并将胡安娜和查理五世重新指定为他的推定继承人。当费尔南多二世于1516年去世时，卡斯蒂利亚和莱昂王国、阿拉贡王国和其他附属王国，包括属地和殖民地都传给了胡安娜和查理五世。由于查理五世仍在佛兰德斯，在费尔南多二世去世后，阿拉贡被费尔南多二世的非婚生子阿隆索·德·阿拉贡统治。一群由第三代因凡塔多公爵迭戈·乌尔塔多·德·门多萨率领的贵族试图宣布斐迪南一世为卡斯蒂利亚国王，但失败了。

1517年10月，17岁的查理在比斯开湾抵达阿斯图里亚斯。11月4日，查理和姐姐奥地利的埃莉诺在托德西利亚斯与他们的母亲胡安娜相见。在那里，他们从胡安娜处争取到了必要的授权，即允许查理以共治者的身份与胡安娜一同统治卡斯蒂利亚、莱昂和阿拉贡。虽然胡安娜默许了查理的企求，但对她的监禁依旧继续。卡斯蒂利亚议会在巴利亚多利德召开，为了泄愤，议员们只称呼查理为“殿下（Su Alteza）”，继续将胡安娜称为“陛下（Majesty）”。但从未有人认真考虑过由胡安娜执政这一现实命题。1519年，阿拉贡王国及其领域，卡斯蒂利亚和莱昂王国及其领域成为共主邦联，由查理统治。此外，查理于同年当选神圣罗马皇帝。

也是在1519年，西班牙爆发反对查理的城市公社暴动，起义者推举胡安娜为唯一的西班牙女王。但是随着暴动于1522年被镇压，胡安娜最终也未能成功登上西班牙的王座。在此之后，为了确保自己的统治和王权，查理将母亲囚禁在卡斯蒂利亚托德西利亚斯的王宫内。这座王宫现已被毁，胡安娜在那里度过了余生。胡安娜的健康状况进一步恶化。她坚信照顾她的一些修女想要杀害她，但她所畏惧之事从未得到证实。据说，胡安娜拒绝用餐、就寝、洗澡和更衣。查理对胡安娜的护理人员写道：“在我看来，对你而言最好和最合适的事是确保没有人能和陛下交谈，因为从中无法得到任何好处。”

在她最后的几年中，胡安娜的身体状况迅速下降，行动愈发不便。1555年4月12日，胡安娜于耶稣受难节当日在托德西利亚斯王宫去世，享年75岁。胡安娜与父母伊莎贝尔一世和费尔南多二世、丈夫腓力一世以及外甥阿斯图里亚斯亲王米格尔·达·帕斯一起被安葬在格拉纳达皇家礼拜堂。

《美男子菲利普》(1845年)—四幕话剧，作者尤赛比奥·阿斯奎利诺和乔治诺·罗梅罗。

《疯狂的爱》(1855年)—话剧，作者曼努埃尔·塔马约·伊·巴乌斯。

《堂娜疯女胡安娜》(19世纪晚期)—歌剧，埃米拉奥·塞拉诺。

《疯女胡安娜》(1877年) —绘画，作者弗朗西斯科·普拉蒂纳（见上），藏于马德里普拉多博物馆。

《疯女胡安娜》(2001年)—电影，文森特·阿兰达导演，皮拉·洛佩兹·德·阿亚拉主演饰胡安娜，12项果雅奖提名，在美国上映时片名为《疯狂的爱》（Mad Love）。改编自曼努埃尔·塔马约·伊·巴乌斯的剧作《疯狂的爱》。

《西班牙公主》（2019年）—迷你剧，Alba Galocha饰演。